首頁>科研服務>轉錄組學與蛋白代謝組學>蛋白組>蛋白質翻譯后修飾

科研服務

火影忍者手游超详细攻略:蛋白質翻譯后修飾

火影忍者剧场版忍者之路 www.vjqvb.icu 蛋白質翻譯后修飾組學產品


常規的蛋白質組學研究往往只關注不同生理、病理條件下蛋白質表達水平的變化。然而,越來越多的研究發現,許多重要的生命活動、疾病發生不僅與蛋白質的豐度相關,更重要的是被各類蛋白質翻譯后修飾所調控。因此深入研究蛋白質翻譯后修飾對揭示生命活動的機理、篩選疾病的臨床標志物、鑒定藥物靶點等方面都具有重要意義。由于翻譯后修飾的蛋白質在生物樣本中含量低、動態范圍廣,質譜分析前需要對修飾進行富集以提高其豐度。


技術原理:


首先將蛋白樣本酶解成肽段混合物,然后使用液相色譜對酶解后的肽段混合物進行組分分離以降低樣本復雜程度,然后通過高質量的修飾類抗體和生物材料對修飾肽段進行富集,最后上樣至液相色譜 - 串聯質譜中進行分析,通過相應的數據庫檢索匹配,一次可鑒定成百上千個修飾位點。


PTM蛋白質修飾位點分析


技術原理:


> 蛋白質磷酸化位點分析


樣品經酶解后,用 TiO2 微球對磷酸化肽段進行富集,富集后的產物由高精度質譜分析,并通過專業軟件完

成數據檢索。


原理11.PNG

> 蛋白質 N- 糖基化位點分析


蛋白質經過酶解后利用凝集素(lectin)富集 N- 糖基化肽段,然后用 N- 糖酰胺酶(PNGase)在 H O 中

切除連接在天冬酰胺殘基(Asn)上的糖鏈。該處理致使 Asn 分子量增加 2.9890Da。最后用高精度 LC-MS

質譜儀檢測脫糖后的肽段,并通過 MASCOT 軟件檢索數據庫,確認脫糖后分子量與其理論分子量的變化以

及糖基化修飾肽段的序列,從而確定該蛋白質的 N- 糖基化位點。


1.PNG

定量磷酸化蛋白質組學


蛋白質發生磷酸化是重要的翻譯后修飾,它與信號傳導、細胞周期、生長發育以及癌癥機理等諸多生物學問題有密切關系。研究蛋白質磷酸化對闡明蛋白質功能具有重要意義。將磷酸化肽段TiO2富集技術和iTRAQ/TMT/Lable free技術相結合,實現對磷酸化蛋白質組學的定量研究。


技術原理


在磷酸化肽段富集前先進行 iTRAQ/TMT 標記,然后通過 TiO2 富集方法獲得高純度的磷酸化肽段,最后結合高分辨率質譜完成對樣品的定量分析。


定量N-糖基化蛋白質組學


蛋白質的N-糖基化位點修飾是最重要的蛋白質翻譯后修飾之一,主要在復雜的多細胞或組織形成過程中起關鍵作用。蛋白質的N-糖基化修飾位點具有保守的氨基酸序列NX(S/T)(其中X為除脯氨酸以外的其它氨基酸)


凝集素親和法是目前糖蛋白質組學中應用最廣泛的分離富集方法。凝集素(lectin)是一類糖結合蛋白質,能專一識別某一特殊結構的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與

之結合,它們與糖鏈可逆非共價結合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后,通常用特定的單糖通過競爭結合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。蛋白質經過酶解后利用lectin 富集 N- 糖基化肽段,然后用 N- 糖酰胺酶(PNGase)在 H218O 中切除連接在天冬酰胺殘基(Asn)上的糖鏈。該處理致使 Asn 分子量增加 2.9890Da。最后用高精度 LC-MS 質譜儀檢測脫糖后的肽段,并通過 MASCOT 軟件檢索數據庫,確認脫糖后分子量與其理論分子量的變化以及糖基化修飾肽段的序列,從而確定該蛋白質的 N- 糖基化位點。N- 糖基化位點確定之后,再利用 label-free 的原理對其進行定量分析。


定量泛素化蛋白質組學


泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下,將細胞內的蛋白質分類,從中選出靶蛋白分子,并對靶蛋白進行特異性修飾的過程。


技術原理


樣品經胰蛋白酶 Trypsin 酶切,酶切產物由泛素化特異性抗體 (Cell Signaling Technology 5562S)進行泛素化肽的富集,富集后由高精度質譜 Q Excative(Thermo Scientific)分析,分析數據由生物信息學軟件進行數據檢索。